유세포분석(Flow Cytometry, FCM)은 물리화학적 특성을 기반으로 세포나 입자를 분석하고 분류하는 빠르고 정확한 실험 방법입니다. 이 기술은 세포 크기, 세분성, 세포 표면 항원 발현 및 DNA 함량과 같은 중요한 파라미터를 평가합니다. 분류 기능이 있는 유세포 분석기를 사용하면 대규모 모집단에서 특정 세포 하위 집합을 분류할 수 있습니다. 분류된 세포는 생명 과학 연구에서 다양한 응용 분야에 상당한 잠재력을 가지고 있습니다.
유세포분석의 특징
유세포분석기의 작동 원리
유세포분석기
유세포분석기는 세포 및 분자 생물학, 유체 역학, 레이저 기술, 광전자 공학, 컴퓨터 기술, 세포 형광 화학 및 항체 기술 분야를 결합한 분석 장비입니다. 이는 세포 또는 입자의 포괄적인 분석 및 분류를 위한 강력한 도구 역할을 합니다.
(2) 유세포분석기의 내부 구조:
광학 시스템: 레이저 광원, 집광 시스템
유체(Fluidic) 시스템: 유동 챔버, 유체 구동 시스템
전자 시스템: 광 검출기, 데이터 처리 시스템
세포 분류 시스템: 노즐, 정전 편향판, 샘플 수집기
필터
필터는 유세포분석기 광학 시스템의 필수 구성 요소입니다. 이를 통해 유세포분석기는 파장에 따라 서로 다른 방출된 빛을 구별할 수 있으므로 여러 감지 채널에서 동시 분석이 가능합니다. 필터는 주로 Long-pass, Short-pass 및 Band-pass의 세 가지 유형으로 분류됩니다.
필터 분류:
Long-pass filter (LP): 특정 파장 이상의 빛만 통과시킵니다.
Short-pass filter (SP): 특정 파장 이하의 빛만 통과시킵니다.
Band-pass filter (BP): 특정 파장 범위 내의 빛만 통과하도록 허용합니다.
유세포분석에서 검출된 신호 유형
단일 세포가 유동 챔버의 레이저 조명 영역으로 흘러 들어가면서 산란되는 빛의 신호와 형광 신호를 방출하고 이는 해당 검출기에 의해 수집됩니다.
산란광 신호
전방 산란(Forward Scatter, FSC): 전방 산란광의 신호 방향은 레이저 빔과 평행하며 각도 편차는 일반적으로 1~6도 범위입니다. 이는 낮은 각도 산란광으로도 알려져 있으며 주로 세포의 상대적인 크기를 나타냅니다. 측면 산란(Side Scatter, SSC): 측면 산란광의 신호 방향은 유체 흐름에 의해 형성된 평면에 수직입니다. 90도 산란광이라고도 합니다. 측면 산란광의 강도는 세포 세분성의 변화와 미세한 구조적 변화를 반영합니다.
(1) 산란광 신호의 응용
유세포분석 실험에서 FSC 및 SSC 매개변수는 서로 다른 세포 집단을 구별하고 세포 잔해, 죽은 세포 및 응집된 세포의 간섭을 제거하는 데 종종 활용됩니다.
FSC를 사용하여 세포 크기를 반영하고 SSC를 사용하여 세포 세분성을 반영하면 다양한 세포 집단을 구별할 수 있습니다.
형광 신호
고유 형광:자가 형광이라고도 합니다. NADPH, 리보플라빈 및 플라빈 조효소와 같은 자연적으로 발생하는 세포 성분은 항원 특이적 신호를 가릴 가능성이 있는 형광 신호를 방출할 수 있습니다.
특이적 형광:세포가 형광 접합 항체 또는 특정 형광 염료로 표지 되면 해당 형광 염료는 해당 레이저에 의해 여기(excitation)되어 특정 파장의 형광을 방출(emission)합니다.
유세포분석 데이터의 그래픽 표현
유세포분석을 사용하면 대규모 세포 샘플을 분석하여 개별 세포에 대한 데이터 포인트를 생성할 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 단일 파라미터는 Histogram, 2가지 파라미터는 Dot Plot 등을 포함하여 유세포분석 데이터를 제공하기 위해 다양한 형식이 사용됩니다. 실험 매개변수와 복잡성이 증가함에 따라 tSNE 및 FlowSOM과 같은 고차원 데이터 분석 기술이 사용되어 연구자는 데이터에서 더 가치 있는 정보를 추출할 수 있습니다.
• Proportions of negative and positive cell populations
• Mean or median fluorescence intensity (MFI)
• Provides a more intuitive representation of cell information
• Enables analysis of specific cell populations or subpopulations
• Contour lines represent areas with the same cell density
• Provides a visual depiction of the concentration of cell populations
• Displays the relative quantity of events in a given area
• Reflects the overall density distribution of cell populations
• Visualizes high-dimensional data in a lower-dimensional space
• Measures the similarity between samples in the high-dimensional space
• Partially restores the high-dimensional structure in the data
• Increases the possibility of discovering rare cell populations
• Displays expression intensity using color gradients from cool to warm
• Rich color variations and vivid representation of information
